在實驗開始前，需將試劑盒從冰箱中拿出來在室溫放置20min，再進行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡，也可使溫育時反應(yīng)孔內(nèi)的溫度能較快的達到所要求的高度，以滿足測定要求。 其次，目前商品中ELISA試劑盒中的洗板液均需在實驗過程中對其所提供的濃縮液進行稀釋配制，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)該保證質(zhì)量。此外，底物反應(yīng)液應(yīng)該反應(yīng)顯色前進行現(xiàn)配現(xiàn)用。同時，為了保證實驗的均一性，實驗中所有試劑在加樣前必須搖勻。

用于ELISA測定最常用的臨床標本是血清（漿）。要注意避免嚴重溶血，因為血紅蛋白中含有具有類似過氧化物活性的血紅素基團，在孵育時很容易吸附于固相，與HRP底物反應(yīng)產(chǎn)生假陽性。 樣品采集及血清分離中要注意避免細菌污染，一方面細菌分泌的酶可能對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用，另一方面，細菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶會對相應(yīng)酶作標記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。 樣品應(yīng)該要避免反復(fù)凍融。因反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機械剪切力對標本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。另外，樣品混勻時，不要劇烈振蕩，反復(fù)顛倒混勻即可。 一般而言，如果在收集樣品的當天進行檢測，可將樣品及時儲存在4℃?zhèn)溆?；而對隔天再檢測的樣本，應(yīng)及時分裝后凍存在-20℃?zhèn)溆?，若要長期保存樣品，最好將其置于-70℃凍存。

誤差分為三類，系統(tǒng)誤差、隨機誤差和過失誤差。這三類誤差中，系統(tǒng)誤差對樣本值和空白值之間的差異無影響。ELISA樣本值低于空白值在誤差方面主要來源于隨機誤差和過失誤差。 隨機誤差?Random?Error 無法控制的變因，使測量值產(chǎn)生隨機分布的誤差，服從統(tǒng)計學上的正態(tài)分布。從統(tǒng)計學上來看，測量值有99%的置信限在±3SD之間，如果CV值是20%，隨機誤差的邊界就是±60%，也就是說在CV值20%的狀況下，樣本值低于空白值60%之內(nèi)，有可能是隨機誤差的影響，特別是空白值只有一個值時。 隨機誤差不可消除，只能通過多次測量獲得的均值盡量逼近真值。降低隨機誤差的解決方案1是增加空白值的重復(fù)數(shù)量，一般認為空白值重復(fù)10次，測量均值接近真值。 方案2是提高實驗技能，也能夠有效降低隨機誤差的影響。如果CV值在5%，樣本值趨近于零時，在統(tǒng)計上樣本值將不會低于空白值15%。 過失誤差?Gross?Error 過失誤差主要是由于測量者的疏忽，犯了不應(yīng)有的錯誤造成的。過失誤差是可以避免的。針對于ELISA樣本值低于空白值的問題，過失誤差產(chǎn)生的原因多數(shù)來源于空白孔HRP的重復(fù)加樣或污染或洗滌不干凈，造成空白值偏高，相對比來說，樣本值低于空白值。解決方案就是重復(fù)實驗，規(guī)范操作。 基質(zhì)效應(yīng)?Matrix?Effect 分析中，基質(zhì)指的是樣本中被分析物之外的組分，基質(zhì)常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準確性，這些影響和干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)。ELISA試劑盒在開發(fā)過程中，標準品不能采用人或動物血清、血漿作為標準曲線的稀釋液，只能采用其模擬物。模擬物與被測樣本在蛋白豐度、復(fù)雜性、pH等因素都會存在差異。當樣本的基質(zhì)與其模擬物相比，降低抗原抗體的結(jié)合，便產(chǎn)生了樣本值低于空白值的現(xiàn)象。造成樣本值無法計算出數(shù)值，或者數(shù)值為負。 目前最常用的去除基質(zhì)效應(yīng)的方法是，通過已知分析物濃度的標準樣品，同時盡可能保持樣本中的基質(zhì)不變，建立一個校正曲線（Calibration?Curve）。 當單個樣本或少量樣本值低于空白值時，可能是誤差原因，這時應(yīng)增加重復(fù)，提高操作技能。當大量樣本都低于空白值時，應(yīng)考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響，建立校正曲線予以修正。

在ELISA實驗中，樣本值低于空白值是一個經(jīng)常性的問題。當樣本值較低接近試劑盒的靈敏度就容易發(fā)生樣本值低于空白值的現(xiàn)象，特別是在血清和血漿樣本的檢測。究其原因，主要在于兩個方面，一方面是誤差，另一方面是基質(zhì)效應(yīng)。下文逐個分析不同影響因素的原理、和解決方案。

血清、血漿樣品請務(wù)必按照說明書要求，與稀釋液1：1稀釋后再加樣。這類樣品蛋白質(zhì)含量高且成分復(fù)雜，容易造成對監(jiān)測孔上的抗原表位的遮蓋，與稀釋液1：1稀釋后可有效避免這一問題。

溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng)，實驗前務(wù)必將所有試劑平衡至室溫，包括檢測樣本。避免因溫度的動力學反應(yīng)差異而導(dǎo)致ELISA檢測結(jié)果的不準確。

首先，酶標儀使用前務(wù)必預(yù)熱10-15min，使測讀結(jié)果更穩(wěn)定。其次，ELISA實驗采用雙波長測定吸光度，可以排除單波長檢測時的測定干擾（標本的濃度，干擾色等）。一般采用最大波長作為參照波長，在參照波長下，檢測物的吸光值最小，檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收；因此，雙波長測定，可最大限度的消除指紋、雜質(zhì)及不透光的物質(zhì)對酶標儀讀數(shù)帶來的誤差，以保證實驗數(shù)據(jù)的準確度。

振蕩孵育使反應(yīng)更充分，振蕩洗滌使背景更干凈。建議使用酶標專用96孔微孔板振蕩器。孵育過程振蕩，可以加快、加強抗原抗體分子間的相互碰撞接觸，使得反應(yīng)過程更加完全，OD值通常會比未振蕩孵育的結(jié)果要高；洗滌過程振蕩，可以使洗板更干凈，在很大程度上能降低背景值，同時可以提高試劑盒檢測的靈敏度。